Microbiologie - Samenvatting Microbiology: a Human Perspective - Hoofdstuk 3 Microscopie Een van de - StudeerSnel (2022)

Hoofdstuk 3 Microscopie

Een van de belangrijkste hulpmiddelen voor het bestuderen van micro-organismen is de lichtmicroscoop, die zichtbaar licht en een reekslenzen gebruikt om objecten te vergroten. Deze instrumenten zijnrelatief eenvoudig te gebruiken en kunnen afbeeldingen ongeveer 1000 Xvergroten (vouw). Ze worden routinematig gebruikt in het laboratoriumom celgrootte, vorm en beweeglijkheid te observeren. Deelektronenmicroopie, geïntroduceerd in 1931, kan afbeeldingen vanmeer dan 100000X vergroten, waardoor veel fijne details van decelstructuur worden onthuld. Een belangrijke vooruitgang kwam in dejaren 1980 met het ontdekken van atomische microscopie mogelijkmaken van wetenschappers om afbeeldingen van individuele atomenop een oppervlak te produceren.

Principes van lichtmicroscopie:

Bij lichtmicroscopie passeert het licht een monster en vervolgens door eenreeks vergrotende lenzen voordat het oog van de waarnemer betreedt.Het meest voorkomende type lichtmicroscoop is helderveldmicroscopiedat het gezichtsveld gelijkmatig verlicht en een heldere achtergrondgenereert.

VergrotingDe moderne lichtmicroscopie, een samengestelde microscoop genaamd,heeft meerdere vergrotende lenzen. De objectieflens is een reekslenzen die zich in een buis bevindt direct boven het object datwordt bekeken, terwijl de ooglens of oculair een lens dicht bij hetoog is (figuur 3,1). Omdat de objectieve en oculaire lenzen in combinatieworden gebruikt, is de totale vergroting gelijk aan het product van devergroting van elke lens. Een structuur wordt bijvoorbeeld 1000 keervergroot weergegeven door een 10x oculaire lens in serie met een 100 X-objectieflens. De meeste samengestelde microscopen hebben een selectievan objectieflenzen met verschillende vermogens, meestal 4X, 10X, 40Xen 100X.De condensorlens, geplaatst tussen de lichtbron en het preparaat,vergroot niet. Het richt het licht op het monster

ResolutieHet nut van een microscoop hangt in de eerste plaats af van hetoplossend vermogen ervan, dat bepaalt hoeveel details in hetwaargenomen specimen kunnen worden gezien. Het oplossen vanvermogen is een maat voor het vermogen om twee objecten dieheel dicht bij elkaar staan te onderscheiden. Het wordt gedefinieerdals de minimale afstand tussen twee punten waarop die punten nog

steeds als afzonderlijke objecten kunnen worden waargenomen. Een hoogoplossend vermogen betekent dat details van een afbeelding duidelijkerzijn.Het oplossend vermogen van een microscoop is afhankelijk van dekwaliteit en het type lens, de golflengte van het licht (korteregolflengten geven een betere resolutie), de vergroting en hoe hetpreparaat is vervaardigd. Het maximale oplossend vermogen van de bestelichtmicroscopie is 0,2 micrometer. Dit is voldoende om de algemenemorfologie van een prokaryotische cel te zien, maar te laag om eenvoorwerp te onderscheiden van de grootte van de meeste virussen.Voor maximale resolutie bij het gebruik van bepaalde hoogvermogendoelen zoals de 100 x-lens, moet immersieolie worden gebruikt om delucht tussen de lens en het preparaat te verplaatsen.Dit voorkomt de breking (buiging van de lichtstralen) die optreedtwanneer licht van glas naar lucht stroomt (fig. 3). Lichtstralen buigenwanneer ze vanuit een medium van één brekingsindex (een maat voor derelatieve snelheid van het licht terwijl deze door het medium passeert)naar een ander gaan. Als breking optreedt, zullen sommige lichtstralen derelatief kleine openingen van de hogere objectieven met een hogerekracht missen, waardoor het beeld er vaag uitziet. De immersieolievoorkomt breking omdat deze bijna dezelfde brekingsindex heeft als glas.

Objectieve lensEen selectie van lensopties biedt verschillende vergrotingen. De totalevergroting is een product van het vergrotende vermogen van de oculairelens en de objectieflens.

Oculairlens (oog stuk)Vergroot het beeld, meestal 10-voudig (10x)

ContrastDe hoeveelheid contrast - het verschil in kleurintensiteit tussen aan hetobject en de achtergrond - heeft invloed op hoe gemakkelijk cellen kunnenworden gezien. Kleurloze micro-organismen zijn bijvoorbeeld in wezentransparant tegen een kleurloze achtergrond in de breedte, dus hetgebrek aan contrast maakt ze moeilijker te zien. (Figuur 3) Een manierom deze moeilijkheid te overwinnen is om de cellen te kleuren met eenvan de verschillende kleurstoffen die binnenkort zullen worden besproken

Lichte microkopie die het contrast verhoogtSpeciale lichtmicroscopen die het contrast tussen micro-organismen enhun omgeving verhogen, overwinnen enkele van de moeilijkheden bij hetwaarnemen van ongekleurde cellen. Ze laten wetenschappers toe omkenmerken van levende organismen zoals beweeglijkheid gemakkelijk tezien. Om levend micro-organisme te bekijken, wordt het monster gemaaktals een natte bevestiging - een druppelvloeistof waarop een dekglaasje isgeplaatst

Straalbreking

materiaal passeert, wordt het lichtjes anders gebroken dan wanneer hetdoor de omgeving passeert. Speciale optische apparaten verdelen dieverschillen, waardoor het contrast wordt verbeterd.

Differentiële interferentie contrast (dic) microscopenMaakt het beeld driedimensionaal (figuur 3,6). Deze microscoop is, netals de fasecontrastmicroscoop, afhankelijk van verschillen in reflectie-index wanneer licht door verschillende materialen passeert. Het heeft eeninrichting voor het scheiden van licht in twee stralen die door hetspecimen gaan en dan opnieuw te combineren, waardoor hetdriedimensionale uiterlijk van De afbeelding.

Lichtmicroscopen die fluorescentie detecterenEen fluorescentiemicroscoop wordt gebruikt om cellen of anderematerialen waar te nemen die ofwel van nature fluorescerend zijn of zijngekleurd met fluorescente kleurstoffen (figuur 3). Fluorescerendemoleculen absorberen licht op één golflengte (meestal ultraviolet licht) enzenden vervolgens licht met een langere golflengte uit. De microscooplegt dan alleen het licht vast dat wordt uitgezonden door defluorescerende moleculen, waardoor fluorescerende cellen eruit springenals heldere objecten tegen een donkere achtergrond. Het type en dekenmerken van fluorescente moleculen die in het proces worden gebruikt,zullen binnenkort worden besproken.

Scannen van lasermicroscopenEen scanning-lasermicroscoop (SLM) kan worden gebruikt voorgedetailleerde binnen aanzichten van intacte cellen die gekleurd zijn meteen fluorescerende kleurstof (figuur 3). Door fluorescente moleculen tegebruiken die alleen aan bepaalde verbindingen binden, kan de preciezecellulaire locatie van die verbindingen worden bepaald. Sommigescanning-lasermicroscopen kunnen ook worden gebruikt omdriedimensionale afbeeldingen van microbiële gemeenschappen of anderedikke structuren te maken.

Bij confocale microscopie richten lenzen een laserstraal om een bepaaldpunt op één verticaal vlak van een monster te verlichten. Spiegelsscannen vervolgens de laserstraal over het preparaat en belichtenopeenvolgende gebieden en vlakken totdat het hele preparaat is gescand.Elk vlak komt overeen met een afbeelding van één fijne dia van hetmonster. Een computer assembleert vervolgens de gegevens enconstrueert een driedimensionale afbeelding, die op een scherm wordtweergegeven. In feite is deze microscoop een miniatuurgecomputeriseerde axiale tomografie (CAT) scan voor cellen

Elektronenmicroscopen

Elektronenmicroscopie is in sommige opzichten vergelijkbaar metlichtmicroscopie, maar het kan een voorwerp 100 overduidelijkvergroten. In plaats van het gebruik van glazen lenzen, zichtbaar licht en

het oog om het monster waar te nemen, gebruikt eenelektronenmicroscoop elektromagnetische lenzen en een fluorescerendscherm om het vergroot te produceren (figuur 3,9). Dat beeld kan wordengefotografeerd, waardoor een beeld wordt gecreëerd dat eenelektronenmicrofoto wordt genoemd. Het beeld is zwart en wit, maar kankunstmatig gekleurd zijn om ervoor te zorgen dat bepaalde componentenopvallen of om visuele belangstelling toe te voegen.Elektronen hebben een golflengte die ongeveer 1000 maal korter is danzichtbaar licht, dus het oplossend vermogen van elektronenmicroscopen isongeveer 1000 maal zo groot als die van lichtmicroscopen - ongeveer 0,nanometer (nm) (zie figuur 1). bijgevolg kan met elektronenmicroscopieaanzienlijk meer detail worden waargenomen.Elektronenmicroscopen zijn complexe instrumenten omdat de lenzen enhet specimen typisch in een vacuüm moeten zijn om luchtmoleculen tevermijden die anders het pad van elektronen zouden verstoren. Debehoefte aan een vacuüm betekent dat de monsterbereiding substantieelen gecompliceerd is en het onmogelijk maakt om levende cellen teobserveren. Er worden technieken ontwikkeld die geen vacuüm vereisen,waardoor het mogelijk wordt om levende cellen te bekijken, maar deverkregen beelden zijn niet zo duidelijk als bij conventionele methoden.

Transmissie-elektronenmicroscopen (TEM) worden gebruikt om fijnedetails van de celstructuur waar te nemen (figuur 3). Het werkt dooreen bundel elektronen te richten die ofwel door het specimen gaan ofverstrooid worden (van richting veranderen), afhankelijk van de dichtheidvan de regio. De donkere delen van het resulterende beeld komenovereen met de dichtere delen van het monster.Een proces met de naam thin-sectioning wordt gebruikt om details van deinterne structuren van een specimen te bekijken. Eerst wordt het monsterbehandeld met een conserveermiddel en gedehydrateerd voordat het inplastic wordt ingepakt. Eenmaal ingebed, kan het monster in uitzonderlijkdunne plakjes worden gesneden met een diamant- of glas mes envervolgens worden gekleurd met zware metalen. Zelfs een enkelebacteriecel moet in plakjes worden gesneden om via TEM bekeken teworden. Helaas kan de procedure de cellen ernstig verstoren en artefactenveroorzaken (kunstmatige structuren geïntroduceerd als resultaat van hetproces). Het onderscheiden van de werkelijke cel componenten vanartefacten die het gevolg zijn van de preparatie van het monster is eengroot probleem.

Een methode genaamd "freeze-fracturing" wordt gebruikt om de vorm vanstructuren binnen een cel te observeren. Het monster wordt snelingevroren en vervolgens wordt breuk gevroren door etsen. Bij dit proceswordt het bevroren oppervlak dat wordt blootgelegd door breken,enigszins onder vacuüm gedroogd, waardoor onderliggende gebiedenkunnen worden belicht.

Scanning-elektronenmicroscoop (SEM's)

3 Als een object dat wordt bekeken onder defasecontrastmicroscoop dezelfde brekingsindex heeft als hetachtergrondmateriaal, hoe zou dit er dan uitzien

3 Preparaten voorbereiden op lichtmicroscopie

Een van de gemakkelijkste manieren om een exemplaar microscopisch teonderzoeken, is een natte hoeveelheid te gebruiken. Dit bestaat uit eendruppel vloeibaar specimen op een microscoopglaasje en bedekt met eendekglaasje, dat een dun laagje vloeistof tussen de glijbaan en hetdekglaasje plaatst. Hoewel een natte berg het mogelijk maakt om levende,bewegende micro-organismen te observeren, kunnen de cellen moeilijk tezien zijn omdat ze bijna transparant zijn en vaak snel bewegen. Om ditprobleem te vermijden, kunnen de cellen worden geïmmobiliseerd envervolgens worden gekleurd met een of meer kleurstoffen.Om een monster voor te bereiden op kleuring, wordt eerst eendruppelvloeistof met het organisme op een objectglaasje gelegd engedroogd (figuur 3). Het resulterende monster vormt een film of smeer.Vervolgens wordt de schuif over een vlam geleid om de cellen aan de diate bevestigen (bevestigen). Als alternatief kan een dia verwarmer wordengebruikt om het monster zowel te drogen als te fixeren. Vervolgens wordtkleurstof toegevoegd volgens een van de hierna beschreven proceduresen samengevat in tabel 3.

Figuur 3.Waarom moet een uitstrijkje worden verhit vóór het kleuren?

Eenvoudige kleuring

Als slechts een enkele kleurstof wordt gebruikt om een monster tekleuren, wordt de procedure eenvoudige kleuring genoemd. Proceduregebruiken meestal basische kleurstoffen, wat betekent dat de kleurstoffeneen positieve lading hebben. Deze kleurstoffen kleuren cellen omdat hetpositief geladen kleurstofdeeltje wordt aangetrokken door het velenegatief geladen cellulaire componenten. Voorbeelden van basischekleurstoffen omvatten methyleenblauw, kristalviolet, safranine enmalachietgroen.Alhoewel zure kleurstoffen geen cellen kleuren, kunnen ze wordengebruikt voor negatieve kleuring, een procedure die de achtergrond kleurt.De cellen stoten de negatief geladen kleurstof af, waardoor de kleurlozecel opvalt tegen de achtergrond. Een voordeel van negatieve kleuring isdat het als een natte bevestiging kan worden gedaan. Dit voorkomt destap van het fixeren van warmte, een proces dat de verdeling van decellen kan vervormen.

Differentieel kleuring

Wordt gebruikt om verschillende groepen bacteriën te onderscheiden. Detwee meest frequent gebruikte differentiële kleuringstechnieken zijn degramkleuring en de zuurvaste kleuring.

GramkleuringDe gramkleuring is veruit de meest gebruikte procedure voor het kleurenvan bacteriën. De basis hiervoor is meer dan een eeuw geledenontwikkeld door Dr. Hans Christian Gram. hij toonde aan dat bacteriënkunnen worden gescheiden in twee hoofdgroepen: grampositievebacteriën en gramnegatieve bacteriën. We weten nu dat het verschil in dekleuringseigenschappen van deze twee groepen een fundamenteelverschil in de structuur van hun celwanden weerspiegelt.

Gramkleuring omvat vier basisstappen (figuur 3)1 - het uitstrijkje wordt eerst overspoeld met de primaire vlek, in dit gevalkristal violet. De primaire kleuring is de eerste kleurstof die wordttoegepast bij differentiële kleuring en kleurt in het algemeen alle cellen.

2- het uitstrijkje wordt gespoeld om overtollige kleurstof te verwijderen envervolgens overstroomd met een oplossing die jodium van gram wordtgenoemd. Het jodium is een bijtmiddel, wat betekent dat het reageert met

Zure-snelle kleuring, zoals gramkleuring, vereist meerdere stappen. Deprimaire vlek is een rode kleurstof, carbol fuchsine, die wordt toegepastals een geconcentreerde oplossing. de dia wordt vervolgens gespoeld omde overmaat aan kleurstof te verwijderen voordat deze wordt overstroomdmet zuur-alcohol, een sterkcollectioneermiddel. Deze agent verwijdert decarbol fuchsine van allesbehalve een paar microbiële soorten die zuur-snelworden genoemd. Methyleenblauw wordt vervolgens als tegenkleuringgebruikt. Als gevolg van de kleuringsprocedure zijn zuurvaste organismenhelder roodachtig roze, waardoor ze gemakkelijk te onderscheiden zijn vande blauwe niet-zure snelle cellen (figuur 3)

Speciale vlekken om celstructuren te observeren

Speciale procedures kunnen ook worden gebruikt om specifieke structurenbinnen of buiten de cel te kleuren. De functie van deze structuren zalverderop in het hoofdstuk nader worden besproken.

Capsule kleuring

Een capsule is een gelachtige laag die bepaalde microben omhult. Dezelaag heeft een beschermende functie en verhoogt daarom depathogeniteit van een organisme. Capsule vlekt slecht, duscapsulevlekken gebruiken doorgaans kleurstoffen die de achtergrondkleuren, waardoor de capsule zichtbaar wordt. Bij één envoudige-methodewordt india-inkt toegevoegd aan een suspensie van cellen om een nattemontage te maken. De fijne inktdeeltjes verdonkeren de achtergrond,waardoor de capsule opvalt als een duidelijk gebied rond een cel (figuur3)

Endospore-kleuring

Leden van bepaalde geslachten, inclusief bacillus en clostridium, van eenspeciaal soort resistente, slapende cel die endospore wordt genoemd.Deze structuren kleuren niet met de gramkleuring, maar ze kunnen vaakworden gezien als heldere, gladde objecten in gekleurde cellen.Om endosporen gemakkelijker zichtbaar te maken, wordt eenendospore-kleuring gebruikt. Deze meerstaps procedure maakt vaakgebruik van malachietgroen als primaire vlek, met zachte verhitting om dekleurstof endosporen te laten binnendringen. Het uitstrijkje wordtvervolgens gespoeld met water, dat de kleurstof verwijdert van allesbehalve de endosporen. Daarna het uitstrijkje met de rode kleurstofsafranin. Met behulp van deze methode zullen de endosporen groen zijnterwijl alle andere cellen roze zullen zijn (figuur 3)

Flagella kleuring

Flagella zijn aanhangsels die het meest algemene bewegingsmechanismevoor prokaryotische cellen verschaffen, maar deze zijn gewoonlijk te dun

om met de lichtmicroscoop te worden gezien. De flagellenkleuringgebruikt een stof die ervoor zorgt dat het kleuringmiddel zich hecht aan dedunne flagellen en deze bedekt, waardoor ze zichtbaar worden met behulpvan een lichtmicroscoop.Niet alle soorten hebben flagellen, dus hun aanwezigheid is eenonderscheidend kenmerk. Bovendien kan de opstelling van flagellen rondeen cel worden gebruikt om een organisme te karakteriseren. Sommigesoorten hebben bijvoorbeeld flagella verdeeld over het oppervlak van eencel - een arrangement dat peritriel wordt genoemd (peri betekent 'rond'),terwijl andere een enkele flagellum hebben aan één uiteinde - eenarrangement dat polair wordt genoemd ( figuur 3). andere regelingenkomen ook voor, met inbegrip van een bundel flagella aan één of beideuiteinden van de cel.

Fluorhoudende kleurstoffen en tagsFluorescentie kan worden gebruikt om de totale cellen, een subset vancellen of cellen met bepaald eiwit op hun oppervlak te observeren,afhankelijk van de procedure (figuur 3). Een voorbeeld is eenfluorescerende kleurstof die zich bindt aan structuren in alle cellen; hetkan worden gebruikt voor het bepalen van het totale aantal microbiëlecellen in een monster. Sommige fluorescerende kleurstoffen binden aande mycolzuren in de celwanden van mycobacterium-soorten, waardoor dekleurstoffen bruikbaar zijn in een kleuringsprocedure vergelijkbaar met dezuur-lichte kleuring.Een soort techniek genaamd immunoflourescence wordt gebruikt omspecifieke celcomponenten te taggen met een fluorescente kleurstof dieaan een antilichaam is bevestigd (zie figuur 18). Door een eiwit telabelen dat uniek is voor een gegeven microbe, kan immunoflourescentieworden gebruikt om dat organisme te detecteren en te identificeren.Antilichamen en hoe ze worden verkregen, worden beschreven in dehoofdstukken 15 en 18.

MicroAssessment 3.Kleurstoffen worden gebruikt om cellen te kleuren, zodat ze tegen eenongekleurde achtergrond kunnen worden gezien. De gramkleuring is demeest gebruikte differentiële kleuring. De zuurvaste kleuring wordtgebruikt om Mycobacterium-soorten te detecteren. Specifieke kleurstoffenen technieken worden gebruikt om celstructuren zoals capsule,endosporen en flagellen te observeren. Fluorescerende kleurstoffen entags kunnen worden gebruikt voor het waarnemen van totale cellen, eensubset van cellen of cellen die bepaalde eiwitten op hun oppervlakhebben.

4 Wat zijn de functies van een primaire kleuring en eentegenkleuring?

5 Beschrijf één fout in de kleuringsprocedure die ertoe zou leidendat een grampositieve bacterie roze verschijnt?

Staphylococcus-soorten, die typisch druiveachtige clusters vormen, zijneen voorbeeld (staphylo betekent "druiventros").

Meercellige verenigingenSommige prokaryoten leven kenmerkend als multicellulaire associaties.Bijvoorbeeld, leden van een groep bacteriën genaamd myxobacteriënglijden over vochtige oppervlakken en vormen zwermen cellen die zichverplaatsen als een pakket. De cellen geven enzymen af en, als eenpakket, degraderen ze organisch materiaal, inclusief andere bacteriëlecellen. Wanneer water of voedingsstoffen beperkend worden, komen decellen samen om een structuur te vormen die afruitend lichaam wordtgenoemd en dat zichtbaar is voor het blote oog.

In hun natuurlijke omgeving leven de meeste bacteriën op het oppervlakin met polymeren omhulde gemeenschappen die biofilms wordengenoemd. Details over deze gemeenschappen worden beschreven inhoofdstuk 4.

MicroAssessment

De meest voorkomende prokaryoten zijn kokken of staven, maar anderevormen omvatten vibrios, spirilla en spirocheten. Cellen kunnen vankarakteristieke groeperingen zoals ketens of clusters. Sommige vanmulticellulaire verenigingen

7 Welke vorm hebben Escherichia coli-cellen?

8 beschrijven de karakteristieke celgroepering van stafylokokspecies?

9 Wat bepaalt of een groep delende cellen ketens of clusters zal vormen?

3 CelwandDoelstellingBeschrijf de chemie en structuur van peptidoglycaan

Vergelijk en contrasteer de structuur en chemie van de Grampositieve enGram-negatieve celwanden

Leg uit hoe de betekenis van lipide A en het O-antigeen van LPS is

Leg uit hoe de celwand de gevoeligheid van penicilline en lysozymebeïnvloedt

Leg uit hoe de celwand de eigenschappen van gramkleuring beïnvloedt

Beschrijf de celwanden van archaea

You might also like

Latest Posts

Article information

Author: Aron Pacocha

Last Updated: 11/09/2022

Views: 5972

Rating: 4.8 / 5 (68 voted)

Reviews: 91% of readers found this page helpful

Author information

Name: Aron Pacocha

Birthday: 1999-08-12

Address: 3808 Moen Corner, Gorczanyport, FL 67364-2074

Phone: +393457723392

Job: Retail Consultant

Hobby: Jewelry making, Cooking, Gaming, Reading, Juggling, Cabaret, Origami

Introduction: My name is Aron Pacocha, I am a happy, tasty, innocent, proud, talented, courageous, magnificent person who loves writing and wants to share my knowledge and understanding with you.